詳述Pcr儀的4大分類及常見問題解答
PCR就是利用DNA聚合酶對特定基因做體外或試管內(nèi)In Vitro的大量合成，基本上它是利用DNA聚合酶進行專1性的連鎖復制。目前經(jīng)常使用的技術(shù)，可以將1段基因復制為原來的1百億至1千億倍。根據(jù)DNA擴增的目的和檢測的標準，可以將PCR儀分為普通PCR儀，梯度PCR儀，原位PCR儀，實時熒光定量PCR儀4類。
普通PCR儀
1般把1次PCR擴增只能運行1個特定退火溫度的PCR儀，稱之為普通PCR儀。如果要用它做不同的退火溫度則需要屢次運行。主要是用作簡單的，對目的基因退火溫度的擴增。
主要利用于科研、教學、臨床醫(yī)學、檢驗、檢疫等。
梯度PCR儀
1次性PCR擴增可以設置1系列不同的退火溫度條件（通常12種溫度梯度）的稱之為梯度PCR儀。由于被擴增的不同的DNA片斷其合適的退火溫度不同，通過設置1系列的梯度退火溫度進行擴增，從而1次性PCR擴增就能夠挑選出表達量高的合適退火溫度進行有效的擴增。主要用于研究未知DNA退火溫度的擴增，這樣既節(jié)儉時間，也節(jié)儉經(jīng)費。在不設置梯度的情況下亦可當作普通的PCR用。正真的梯度，是每排管都有精確的加熱控溫探頭，2009年為止只有美國ABI公司可以做到。其他的都是從兩頭的熱傳遞來設計控溫。
梯度PCR儀多利用于科研、教學機構(gòu)。
原位PCR儀
（有些品牌的PCR儀具有普通PCR、梯度PCR、原位PCR的功能，通過替換模塊進行多用處展開實驗工作）
是用于從細胞內(nèi)靶DNA的定位分析的細胞內(nèi)基因擴增儀。如病原基因在細胞的位置或目的基因在細胞內(nèi)的作用鑄造試驗儀器位置等。可保持細胞或組織的完全性，使PCR反應體系滲透到組織和細胞中，在細胞的靶DNA所在的位置進行基因擴增。不但可以檢測到靶DNA，還能標出靶序列在細胞內(nèi)的位置。于份子和細胞水平上研究疾病的病發(fā)機理和臨床進程及病理的轉(zhuǎn)變有側(cè)重大的實用價值。
實時熒光定量PCR儀
在普通PCR儀設計基礎上增加熒光信號激起和收集系統(tǒng)和計算機分析處理系統(tǒng)，構(gòu)成了具有熒光定量PCR功能的儀器。其PCR擴增原理和普通PCR擴增原理相同，在PCR擴增時加入的引物是利用同位素、熒光素等進行標記，使用引物和熒光探針同時與模板特異性結(jié)合擴增。擴增的結(jié)果通過熒光信號收集系統(tǒng)實時收集信號連接輸送到計算機分析處理系統(tǒng)，得出量化的實時結(jié)果輸出。
熒光定量PCR儀有單通道，雙通道和多通道之分。當只用1種熒光探針標記的時候，選用單通道；有多種熒光標記的時候使用多通道。單通道也能夠檢測多熒光的標記和目的基因表達產(chǎn)物，由于1次只能檢測1種目的基因的擴增量，需屢次擴增才能檢測完不同的目的基因片斷的量。多通道利于做多重PCR，實現(xiàn)1次檢測多種目的基因的功能。
實時熒光定量PCR儀主要利用于臨床醫(yī)學檢測、生物醫(yī)藥研發(fā)、食品行業(yè)、科研院校等。
PCR儀常見問題及回答
1. cDNA產(chǎn)量的很低可能的緣由：*RNA模板質(zhì)量低*對mRNA濃度估計太高*反應體系中存在反轉(zhuǎn)錄酶抑制劑或反轉(zhuǎn)錄酶量不足*同位素磷32過期*反應體積過大，不應超過50μl2. 擴增產(chǎn)物在電泳分析時沒有條帶或條帶很淺*多見的緣由在于您的反應體系是PCR的反應體系而不是RT-PCR的反應體系*與反應起始時RNA的總量及純度有關(guān)*建議在實驗中加入對比RNA*第1鏈的反應產(chǎn)物在進行PCR擴增時，在總的反應體系中的含量不要超過1/10*建議用Oligo(dT)或隨機引物代替基因特異性引物（GSP）用于第1鏈合成。由于RNA模板存在2級結(jié)構(gòu)，如環(huán)狀結(jié)果，有可能致使GSP沒法與模板退火；或SSⅡ反轉(zhuǎn)錄酶沒法從此引物進行有效延伸。*目的mRNA中含有強的轉(zhuǎn)錄中斷位點，可以試用以下方法解決：a. 將第1鏈的反應溫度提高至50℃。b. 使用隨機6聚體代替Oligo(dT)進行第1鏈反應。3. 產(chǎn)生非特異性條帶*用RT陰性對比檢測是不是被基因組DNA污染。如果RT陰性對比的PCR結(jié)果也顯示一樣條帶，則需要用DNase I重新處理樣品。*在PCR反應中，非特異的起始擴增將致使產(chǎn)生非特異性結(jié)果。在低于引物Tm 2至5℃的溫度下進行退火，下降鎂離子或是目的DNA的量將減少非特異性結(jié)果的產(chǎn)生。*由于mRNA剪切方式的不同，根據(jù)選擇引物的不同將致使產(chǎn)生不同的RT-PCR結(jié)果。
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